假病毒包装和检测方法，假病毒感染 CEM 细胞来源: 日期：2011-4-11 (共有 0 条评论) 我要评论我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。 (一)材料 1．质粒 pNL-Luc-R-Env-或 pNL-Luc-R+Env-：质粒包含 HIV-1 前病毒克隆 pNL4.3 的大部分基 因组，荧光素酶基因 Luc 代替了 HIV 的 nef 基因，HIV 的 env 基因发生了移码突变，R-为 vpr 基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达 G2 期。 pSV7d-Env：质粒把 HIV-1 的外壳蛋白基因(如 HXB2、JR．FL、ADA、BAL 的 env 基因) 插入质粒载体 pSV7d。 两个质粒为 Amp 抗性hiv病毒，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。 2．细胞系和培养基 HOS 细胞或 U87 细胞的培养基为 DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。 悬浮细胞的 培养基为 RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。一般情况下，需要加入 puromycin(1ug／ m1)来维持共受体分子的长期表达。 3．Ca3(P04)2 转染试剂 2× HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。
加去离子水 至 100ml， pH 至 7． 调 05～7． 灭菌后 4~C 保存； 0mol／L CaC12： 40g CaCl2.H2O， 15， 2． 29． 加去离子水至 100ml，灭菌；去离子水，灭菌。 4．感染试剂和荧光素酶检测试剂 Polybrene(Sigma)8mg／ml 溶于 PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。 (二)方 法1．假病毒粒子的包装 1)转染前一天， 293 或 293T 细胞至 10cm 培养皿， 传 细胞数为 2× 10^6 个／10mlDMEM ／10％FBS 2)用 10ug 的 pNL-Luc-R+Env-和 10ug 的 pSV7d-Env 两个质粒共转染 293 细胞。转染 前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用 450ul 去离子水重悬这两个质粒，加入 70ul 的 2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入 500u1 的 2× HBS，冰上静置 30min，逐滴加人 293 细胞中；3)转染 24h 后换培养基； 4)转染 48h 后收上清，用 0．45umol／L 的滤膜过滤细胞沉淀； 5)分装成 lml 小管，一 80℃保存，取少量检测 p24 蛋白含量或逆转录酶含量。
2．假病毒感染 HOS 细胞或 U87 细胞 1)感染前一天，传 HOS．CD4 细胞或 U87．CD4 细胞(表达共受体分子)至 24 孔板， 5× 10^3 个／孔／1ml DMEM／10％FBS(不加嘌呤霉素)。 2)把培养基换成含假病毒(10ng p24)的 0．5ml 的 DMEM／10％FBS，可加入终浓度为 8ug／ml 的 Polybrene 来增强病毒感染力，也可不加。同时，加入不同浓度梯度的药物。 3)5~18h 后更换含不同浓度梯度药物的新鲜培养基。 4)转染后 3 天，收集细胞：弃培养基后，用 lml PBS 洗涤细胞，重悬细胞后，100g 离 心 5min 细胞弃上清，用 200ul 的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育 2min。 5)12 000g 离心 2min 取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光 素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的 EC50 值。 3．假病毒感染 CEM 细胞 1)感染前一天，传 CEM 细胞，培养基为 RPMI-1640／10%FBS； 2)调 CEM 细胞数为 3× 10^5／ml， 加细胞 300u1/孔至 24 孔板， 同时加入假病毒(10ng p24)和不同浓度梯度的药物； 3)3～5h 后加入含不同浓度梯度的药物的 0．5ml 培养基； 4)转染后 3 天， 收集细胞： 1． 用 5ml 的离心管收细胞后， 100g 离心 5rain 细胞弃上清， 用 200ul 的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育 2min； 5)12 000g 离心 2min 取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光 素酶读值。
计算药物抑制假病毒复制的 ECso 值。 ①假病毒也能感染一些原代细胞，如 PBMC，但检测时间为 5～10 天。 ②为获得较高的荧光素酶读值， 高效的转染是关键。 如果包装的假病毒滴度比较低(p24 抗原的浓度小于 50~100ng／ml 时)，假病毒感染 293 细胞后，荧光素酶读值会非常低。此 外，假病毒的宿主细胞 293 细胞的状态非常重要，因为 293 细胞是非常灵敏的。如果感染 假病毒前，293 细胞贴壁性不好或 293 细胞形态不饱满，感染效率也是很低的，荧光素酶读 值也会很低，可以考虑用 293T 细胞来代替 293 细胞。③荧光素酶的底物产生的荧光是非常强的，但产生的荧光也很短暂hiv病毒，半衰期为 5min 左 右，Packard 公司提供的荧光素酶试剂盒产生的荧光半衰期要长一些，为 lh 左右，如果检测 时间需要比较长的话，可用 Packard 公司产品。 ④假病毒从一 80℃融化后，应立即使用；即便马上再次冻融，活性也只有原来的一半 左右。 ⑤一般来说，包含 AMLV 或 VSV 病毒衣壳蛋白的假病毒的感染力要比包含 HIV 衣壳蛋 白的假病毒活性高 1～2 倍，用 AMLV 病毒衣壳蛋白的假病毒感染细胞时，假病毒的推荐用 量是 5ng 左右。 ⑥在用假病毒检测化合物活性时，注意化合物的自发荧光对检测效果的影响。 ⑦因感染和复制过程不同，假病毒不能完全替代活病毒，经假病毒筛选后的活性物质 应使用活病毒确证其活性。
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